Новый метод стабилизации крови, разработанный в Центре медицинской инженерии Массачусетса, значительно продлевает продолжительность жизни образцов крови для микрофлюидной сортировки и профилирования транскриптов редких циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК), живых раковых клеток, переносимых в кровотоке. Эта работа, которая преодолевает значительный барьер для перевода жидких биопсийных технологий для точной онкологии, недавно была опубликована в Nature Communications.

Единственным одобренным FDA методом стабилизации крови для анализов ЦОК является химическая фиксация, которая убивает клетки и сильно снижает чувствительные биомолекулы, особенно РНК (Рибонуклеиновая кислота).

«Химическая фиксация клеток убивает возможность использования их клинически значимыми способами», - говорит ведущий автор Кейт Вонг. «Нам нужно уметь изучать транскриптомы опухолевых клеток, чтобы понять, как опухоль влияет на определенные молекулярные пути в ответ на лечение. Кроме того, мы хотим культивировать эти клетки для персонализированного тестирования на лекарства и для этого нужны живые клетки».

При выделении этих чрезвычайно хрупких и редких клеток из свежей необработанной крови важную роль играет время. Даже незначительные изменения в качестве образца крови, такие как разрушение эритроцитов, активация лейкоцитов или образование сгустка, сильно влияют на механизмы сортировки клеток и качество биомолекул, выделенных для выявления рака. Согласно опубликованным исследованиям, важные факторы, такие как общее количество циркулирующих опухолевых клеток в образце и количество высококачественной РНК, уменьшаются примерно на 50 процентов в течение первых четырех-пяти часов после отбора проб.

Вонг объясняет: «В Массачусетсе мы настолько интегрированным с клинической группой, что мы можем обрабатывать образцы крови в лаборатории, как правило, в течение часа или двух после того, как они взяты. Но чтобы сделать эти жидкие биопсийные технологии обычными лабораторными тестами для остального мира, нам нужны способы уметь сохранять кровь "живой" намного дольше, чем несколько часов, поскольку эти анализы лучше всего выполнять в центральных лабораториях по соображениям экономической эффективности и воспроизводимости».

Ученые приняли комплексный подход, целью которого является сохранение крови в ее исходном состоянии с минимальными изменениями. Со-ведущий автор Шеннон Тессиер, доктор философии, говорит: «Мы хотели как можно быстрее замедлить биологические часы, используя гипотермию, но это не так просто, как кажется. Низкая температура - это мощное средство для понижения метаболизма, но одновременно возникает множество нежелательных побочных эффектов. В некотором роде эти проблемы схожи с теми, с которыми мы сталкиваемся при сохранении органов, где мы должны оптимизировать стратегии для сложного сочетания клеток».

Для достижения этих целей команда сначала систематически анализировала условия хранения, которые оптимально сохраняли жизнеспособность разнообразных типов клеток в цельной крови. Оказалось, что самой большой проблемой была активация тромбоцитов. Вонг объясняет: «Мы хорошо сохраняем кровь, в том числе функцию коагуляции тромбоцитов, но, к сожалению, охлаждение вызывает глубокую активацию тромбоцитов. Теперь нам нужен целенаправленный подход к тромбоцитам, чтобы они не образовывали сгустки в устройстве для сортировки микрофлюидной крови».

Затем группа проанализировала различные антиагрегантные агенты и обнаружила, что ингибиторы гликопротеина IIb / IIIa, которые часто используются в сердечно-сосудистой медицине, были чрезвычайно эффективны в противодействии вызванной охлаждением агрегации тромбоцитов. Команда сообщает, что использование этих стратегий - в дополнение к короткой обработке хелатированием ионов, которая удаляет активированные липкие тромбоциты из лейкоцитов, - позволяет сохранять  кровь невредимой для исследования в течение трех дней, так как если бы она была свежей - только извлеченной, с высокой чистотой и практически без потерь в количестве КТК.

Тессиер говорит: «Критическое достижение здесь состоит в том, что изолированные опухолевые клетки содержат высококачественную РНК, которая подходит для требовательных молекулярных анализов, таких как одноклеточный qPCR, капельная цифровая ПЦР и секвенирование РНК».

Используя образцы крови из группы из 10 пациентов с метастатическим раком предстательной железы, команда сравнила использование сохраненной крови против парных свежих образцов у тех же пациентов для анализа ЦОК.(Узнать о лечении рака предстательной железы в Израиле). В целом, было достигнуто 92-процентное совпадение в выявлении 12 раковых специфических транскриптов гена между свежими и сохраненными образцами, и было 100-процентное совпадение в обнаружении транскрипта под названием AR-V7. Недавно опубликованные исследования сообщают, что присутствие мРНК AR-V7 в ЦОК рака предстательной железы предсказывает устойчивость к ингибиторам андрогеновых рецепторов, что указывает на то, что химиотерапия может быть лучшим вариантом для таких пациентов.

«Способность сохранять кровь в течение нескольких дней и все еще быть в состоянии подобрать этот клинически значимый биомаркер замечательна», - говорит соавтор Дэвид Миямото, доктор медицины, доктор философии, Центр рака MGH. «Это интересно для врачей, потому что мРНК AR-V7 может быть обнаружена только с использованием ЦОК, а не с циркулирующей опухолевой ДНК или другими бесклеточными анализами».

Команда подчеркивает универсальный характер этого подхода к стабилизации, указывая на его совместимость с очень требовательным микрожидкостным устройством CTC-iChip, которое изолирует опухолевые клетки путем быстрого удаления клеток крови, что подразумевает, что потенциальное воздействие этой работы выходит за рамки обнаружения рака. Вонг говорит: «С захватывающими прорывами в иммунотерапии, трансплантации стволовых клеток и регенеративной медицине, в которых периферическая кровь часто является источником клеток для функциональных анализов или экс-экспрессий, способность сохранять живые клетки облегчит логистические сроки и уменьшит стоимость сложных клеточных анализов».

Источник: Nature Communications

Дата публикации: 
вторник, января 9, 2018